Die beiden zentralen Zeichen in Von Mäusen und Männern sind George Milton und Lennie Small, zwei Wanderarbeiter, die in den 1930er Jahren in Südkalifornien auf der Suche nach Arbeit sind. Als das Buch beginnt, sind George und Lennie gerade auf einer neuen Ranch angekommen. dort treffen George und Lennie - und durch sie die Leser - eine faszinierende Besetzung von Charakteren.
Lennie Small ist eine große, gutherzige Wanderarbeiterin mit einer geistigen Behinderung. Er verlässt sich auf George Milton, seinen lebenslangen Freund und Arbeitskollegen, um Führung und Sicherheit zu gewährleisten. In Georges Gegenwart verschiebt sich Lennie seinem maßgeblichen Freund, aber wenn George nicht da ist, spricht Lennie freier. Manchmal lässt er sich Informationen entgehen, die George ihm verheimlichen sollte, wie ihren Plan, ein Grundstück zu kaufen.
Lennie liebt es, alles Weiche anzufassen, vom Stoff über das Fell einer Maus bis zum Haar einer Frau. Er ist ein klassischer sanfter Riese, der niemals Schaden anrichten will, aber seine körperliche Kraft führt unbeabsichtigt zur Zerstörung. Wir erfahren von George, dass er und Lennie ihre letzte Farm verlassen mussten, weil Lennie nicht davon absehen konnte, das Kleid einer Frau zu berühren, und schließlich der Vergewaltigung beschuldigt wurde. Wenn Lennie einen Welpen von einem der anderen Feldarbeiter als Geschenk erhält, tötet er ihn versehentlich, indem er ihn zu stark streichelt. Lennies Unfähigkeit, seine körperliche Stärke einzuschränken, führt bei beiden Männern zu Problemen, insbesondere, wenn er versehentlich Curleys Frau tötet.
George Milton ist sowohl ein herrschsüchtiger Anführer als auch ein treuer Beschützer von Lennie. Die beiden Männer sind zusammen aufgewachsen, aber George übt aufgrund von Lennies Abhängigkeit eine größere Autorität in der Freundschaft aus.
George und Lennie reden häufig darüber, ihr eigenes Land zu bekommen. Lennie scheint diesen Plan sehr ernst zu nehmen, aber Georges Engagement ist weniger klar. Zum Beispiel, anstatt Geld zu sparen, um in Zukunft Land zu kaufen, sprengt George seine Ersparnisse in einer Nacht, während er in einer Bar küsst.
George beschwert sich manchmal über seine Fürsorgerolle, aber er ist eindeutig entschlossen, nach Lennie Ausschau zu halten. Seine Argumentation wird jedoch nie klar erklärt. Es kann sein, dass George bei Lennie bleibt, weil die Beziehung ihm ein Gefühl der Autorität gibt, wenn sein Leben ansonsten nicht selbstbestimmt ist. Wahrscheinlich tröstet er sich auch mit Lennies Vertrautheit, da die beiden Männer regelmäßig reisen und nirgendwo einen hohen Anspruch erheben.
Nachdem Lennie versehentlich Curleys Frau getötet hat, beschließt George, Lennie zu töten. Die Entscheidung ist ein Akt der Barmherzigkeit, um seinem Freund das Leiden durch die anderen Feldarbeiter zu ersparen.
Curley ist der aggressive, kleinwüchsige Sohn des Ranchbesitzers. Er stolziert autoritär auf der Farm herum und soll ein ehemaliger Boxer mit goldenen Handschuhen sein. Curley kämpft ständig, besonders mit Lennie. Ein solcher Kampf führt dazu, dass Lennie Curleys Hand zerquetscht.
Curley trägt immer einen Handschuh an einer seiner Hände. Die anderen Arbeiter behaupten, der Handschuh sei mit Lotion gefüllt, um seine Hand für seine Frau zart zu halten. Curley ist in der Tat sehr eifersüchtig und beschützt seine Frau, und er befürchtet häufig, dass sie mit den anderen Arbeitern flirtet. Nachdem Lennie versehentlich Curleys Frau getötet hat, führt Curley die anderen Arbeiter auf eine mörderische Jagd nach dem Neuankömmling.
Candy ist ein alternder Handwerker auf einer Ranch, der vor Jahren bei einem Unfall eine Hand verloren hat. Aufgrund seiner Behinderung und seines Alters macht sich Candy Sorgen um seine Zukunft auf dem Bauernhof. Als Lennie verrät, dass er und George vorhaben, ihr eigenes Land zu kaufen, hat Candy das Gefühl, einen Glücksfall erlebt zu haben, und er bietet 350 Dollar an, um sich ihnen anzuschließen. Candy glaubt genau wie Lennie wirklich an diesen Plan, weshalb er George und Lennie während der gesamten Novelle mitfühlend gegenübersteht und George sogar dabei hilft, die Suche nach Lennie nach dem Tod von Curleys Frau hinauszuzögern.
Crooks, der seinen Spitznamen wegen seiner missgestalteten Rückseite erhielt, ist eine stabile Hand und der einzige afroamerikanische Arbeiter auf der Ranch. Wegen seiner Rasse ist es Crooks nicht gestattet, mit den anderen Arbeitern in der Scheune zu leben. Crooks ist bitter und zynisch, versteht sich aber trotzdem gut mit Lennie, die den Rassismus der anderen Arbeiter nicht teilt.
Obwohl George ihn zur Verschwiegenheit verpflichtet hat, sagt Lennie Crooks, dass er und George vorhaben, Land zu kaufen. Crooks drückt tiefe Skepsis aus. Er erzählt Lennie, dass er alle möglichen Leute über alle möglichen Pläne sprechen gehört hat, aber dass keiner von ihnen jemals wirklich passiert ist.
Später in der gleichen Szene kommt Curleys Frau auf die beiden Männer zu und plaudert kokett. Als Crooks sie auffordert zu gehen, schleudert Curleys Frau rassistische Schimpfwörter auf ihn und sagt, dass sie ihn lynchen lassen könnte. Der Vorfall ist demütigend für Crooks, der sich dann bei Curleys Frau vor Lennie und Candy entschuldigen muss, obwohl er die ungerechtfertigte Partei ist.
Curleys Frau ist eine junge, hübsche Frau, deren Name in der Novelle nie erwähnt wird. Ihr Ehemann, Curley, ist eifersüchtig und misstrauisch und er schnippt sie häufig an. Sie hat eine süße Seite, die demonstriert wird, wenn sie Lennie von ihren Kindheitsträumen von Filmstar erzählt, sowie von einer grausamen Serie, wie der rassistische verbale Angriff zeigt, den sie bei Crooks startet. Curleys Frau beschleunigt den Höhepunkt des Buches, indem sie Lennie bittet, sich die Haare zu streicheln, woraufhin Lennie sie versehentlich tötet. Curleys Frau ist weniger entwickelt als andere Charaktere, und sie scheint hauptsächlich dazu zu dienen, die Verschwörung voranzutreiben und Konflikte zu schüren.