Gram-Färbeverfahren in der Mikrobiologie

Die Gram-Färbung ist eine differenzierte Färbemethode, mit der Bakterien auf der Grundlage der Eigenschaften ihrer Zellwände einer von zwei Gruppen (grampositiv und gramnegativ) zugeordnet werden. Es ist auch als Gram-Färbung oder Gram-Methode bekannt. Das Verfahren ist nach dem dänischen Bakteriologen Hans Christian Gram benannt, der die Technik entwickelt hat.

So wirkt der Gram-Fleck

Das Verfahren basiert auf der Reaktion zwischen Peptidoglycan in den Zellwänden einiger Bakterien. Bei der Gram-Färbung werden Bakterien angefärbt, die Farbe mit einem Beizmittel fixiert, die Zellen entfärbt und eine Gegenfärbung angewendet.

1. Die Primärfärbung (Kristallviolett) bindet an Peptidoglycan und färbt die Zellen violett. Sowohl grampositive als auch gramnegative Zellen haben Peptidoglycan in ihren Zellwänden, daher färben sich anfangs alle Bakterien violett.
2. Grams Jod (Jod und Kaliumjodid) wird als Beize oder Fixativ angewendet. Grampositive Zellen bilden einen Kristallviolett-Jod-Komplex.
3. Alkohol oder Aceton werden verwendet, um die Zellen zu entfärben. Gramnegative Bakterien haben viel weniger Peptidoglycan in ihren Zellwänden, so dass sie durch diesen Schritt im Wesentlichen farblos werden, während nur ein Teil der Farbe von grampositiven Zellen entfernt wird, die mehr Peptidoglycan enthalten (60-90% der Zellwand). Die dicke Zellwand von grampositiven Zellen wird durch den Entfärbungsschritt entwässert, wodurch sie schrumpfen und den Fleck-Jod-Komplex im Inneren einschließen.
4. Nach dem Entfärben wird eine Gegenfärbung (normalerweise Safranin, manchmal auch Fuchsin) aufgetragen, um die Bakterien rosa zu färben. Sowohl grampositive als auch gramnegative Bakterien nehmen den rosa Fleck auf, aber er ist über dem dunkleren Purpur der grampositiven Bakterien nicht sichtbar. Wenn das Färbeverfahren korrekt durchgeführt wird, sind grampositive Bakterien lila, während gramnegative Bakterien rosa sind.

Zweck der Gram-Färbetechnik

Die Ergebnisse der Gram-Färbung werden unter Verwendung von Lichtmikroskopie betrachtet. Da die Bakterien gefärbt sind, wird nicht nur ihre Gram-Fleckgruppe identifiziert, sondern auch ihre Form, Größe und das Klumpenmuster können beobachtet werden. Dies macht den Gram-Fleck zu einem wertvollen diagnostischen Instrument für eine medizinische Klinik oder ein Labor. Während der Fleck Bakterien möglicherweise nicht eindeutig identifiziert, reicht es oft aus, zu wissen, ob sie grampositiv oder gramnegativ sind, um ein wirksames Antibiotikum zu verschreiben.

Einschränkungen der Technik

Einige Bakterien können gramvariabel oder gramunbestimmt sein. Selbst diese Informationen können jedoch hilfreich sein, um die bakterielle Identität einzugrenzen. Die Technik ist am zuverlässigsten, wenn die Kulturen weniger als 24 Stunden alt sind. Während es auf Brühenkulturen angewendet werden kann, ist es am besten, sie zuerst zu zentrifugieren. Die hauptsächliche Einschränkung der Technik besteht darin, dass sie fehlerhafte Ergebnisse liefert, wenn Fehler in der Technik gemacht werden. Übung und Geschick sind erforderlich, um ein zuverlässiges Ergebnis zu erzielen. Ein infektiöser Erreger kann auch nicht bakteriell sein. Eukaryontische Krankheitserreger färben sich gramnegativ. Die meisten eukaryotischen Zellen mit Ausnahme von Pilzen (einschließlich Hefe) haften jedoch während des Vorgangs nicht am Objektträger.

Gram-Färbeverfahren

Materialien

• Kristallviolett (Primärfärbung)
• Grams Jod (Beize, um Kristallviolett in der Zellwand zu fixieren)
• Ethanol oder Aceton (Entfärber)
• Safranin (Sekundär- oder Gegenfärbung)
• Wasser in einer Spritzflasche oder Tropfflasche
• Mikroskopische Objektträger
• Verbindungsmikroskop

Schritte

1. Einen kleinen Tropfen Bakterienprobe auf einen Objektträger geben. Durch Erhitzen werden die Bakterien auf dem Objektträger fixiert, indem sie dreimal durch die Flamme eines Bunsenbrenners geleitet werden. Zu lange oder zu viel Wärme kann die Zellwände der Bakterien zum Schmelzen bringen, ihre Form verzerren und zu ungenauen Ergebnissen führen. Wenn zu wenig Hitze angewendet wird, waschen sich die Bakterien während der Färbung vom Objektträger ab.
2. Mit einer Pipette den Primärfleck (Kristallviolett) auf den Objektträger auftragen und 1 Minute einwirken lassen. Spülen Sie den Objektträger vorsichtig nicht länger als 5 Sekunden mit Wasser, um überschüssigen Fleck zu entfernen. Ein zu langes Spülen kann zu viel Farbe entfernen, während ein zu langes Spülen zu viel Flecken auf den gramnegativen Zellen hinterlassen kann.
3. Verwenden Sie eine Pipette, um Grams Jod auf den Objektträger aufzutragen und das Kristallviolett an der Zellwand zu befestigen. 1 Minute ruhen lassen.
4. Spülen Sie den Objektträger ca. 3 Sekunden lang mit Alkohol oder Aceton und anschließend sofort mit Wasser ab. Die gramnegativen Zellen verlieren an Farbe, während die gramnegativen Zellen violett oder blau bleiben. Wenn der Entfärber jedoch zu lange eingeschaltet bleibt, verlieren alle Zellen ihre Farbe!
5. Tragen Sie den Sekundärfleck Safranin auf und lassen Sie ihn 1 Minute einwirken. Spülen Sie vorsichtig nicht länger als 5 Sekunden mit Wasser. Die gramnegativen Zellen sollten rot oder rosa gefärbt sein, während die gramnegativen Zellen noch lila oder blau erscheinen.
6. Betrachten Sie den Objektträger mit einem zusammengesetzten Mikroskop. Eine Vergrößerung von 500x bis 1000x kann erforderlich sein, um die Zellform und -anordnung zu unterscheiden.

Beispiele für grampositive und gramnegative Krankheitserreger

Nicht alle durch die Gram-Färbung identifizierten Bakterien sind mit Krankheiten assoziiert, aber einige wichtige Beispiele sind:

• Grampositive Kokken (rund): Staphylococcus aureus
• Gramnegative Kokken: Meningokokken
• Grampositive Bazillen (Stäbchen): Bacillus anthracis
• Gramnegative Bazillen: Escherichia coli