Wie schneiden Restriktionsenzyme DNA-Sequenzen?

In der Natur müssen sich Organismen selbst auf mikroskopischer Ebene ständig vor fremden Eindringlingen schützen. In Bakterien gibt es eine Gruppe bakterieller Enzyme, die Fremd-DNA abbauen. Dieser Abbauprozess wird Restriktion genannt und die Enzyme, die diesen Prozess ausführen, werden Restriktionsenzyme genannt.

Restriktionsenzyme sind in der rekombinanten DNA-Technologie sehr wichtig. Restriktionsenzyme wurden verwendet, um Impfstoffe, pharmazeutische Produkte, insektenresistente Pflanzen und eine Vielzahl anderer Produkte herzustellen.

Die zentralen Thesen

• Restriktionsenzyme zerlegen fremde DNA, indem sie sie in Fragmente schneiden. Dieser Zerlegungsprozess wird als Einschränkung bezeichnet.
• Die rekombinante DNA-Technologie beruht auf Restriktionsenzymen, um neue Kombinationen von Genen herzustellen.
• Die Zelle schützt ihre eigene DNA vor dem Zerfall, indem sie in einem als Modifikation bezeichneten Prozess Methylgruppen hinzufügt.
• DNA-Ligase ist ein sehr wichtiges Enzym, das dabei hilft, DNA-Stränge über kovalente Bindungen miteinander zu verbinden.

Was ist ein Restriktionsenzym??

Restriktionsenzyme sind eine Klasse von Enzymen, die DNA basierend auf der Erkennung einer bestimmten Sequenz von Nukleotiden in Fragmente schneiden. Restriktionsenzyme sind auch als Restriktionsendonukleasen bekannt.

Zwar gibt es Hunderte verschiedener Restriktionsenzyme, doch arbeiten sie alle im Wesentlichen auf die gleiche Weise. Jedes Enzym hat eine sogenannte Erkennungssequenz oder -stelle. Eine Erkennungssequenz ist typischerweise eine spezifische kurze Nukleotidsequenz in der DNA. Die Enzyme schneiden an bestimmten Stellen innerhalb der erkannten Sequenz. Beispielsweise kann ein Restriktionsenzym eine spezifische Sequenz von Guanin, Adenin, Adenin, Thymin, Thymin, Cytosin erkennen. Wenn diese Sequenz vorliegt, kann das Enzym gestaffelte Schnitte in das Zucker-Phosphat-Rückgrat in der Sequenz ausführen.

Aber wenn Restriktionsenzyme auf der Grundlage einer bestimmten Sequenz geschnitten werden, wie schützen Zellen wie Bakterien ihre eigene DNA davor, von Restriktionsenzymen gespalten zu werden? In einer typischen Zelle sind Methylgruppen (CH₃) werden den Basen in der Sequenz zugesetzt, um die Erkennung durch die Restriktionsenzyme zu verhindern. Dieser Prozess wird von komplementären Enzymen durchgeführt, die dieselbe Sequenz von Nukleotidbasen wie Restriktionsenzyme erkennen. Die Methylierung von DNA wird als Modifikation bezeichnet. Mit den Prozessen der Modifikation und Restriktion können Zellen sowohl fremde DNA, die eine Gefahr für die Zelle darstellt, zerschneiden als auch die wichtige DNA der Zelle erhalten.

Basierend auf der Doppelstrangkonfiguration der DNA sind die Erkennungssequenzen auf den verschiedenen Ständen symmetrisch, laufen jedoch in entgegengesetzte Richtungen. Denken Sie daran, dass die DNA eine "Richtung" hat, die durch die Art des Kohlenstoffs am Ende des Strangs angezeigt wird. Am 5'-Ende ist eine Phosphatgruppe gebunden, während am anderen 3'-Ende eine Hydroxylgruppe gebunden ist. Beispielsweise:

5'-Ende -… Guanin, Adenin, Adenin, Thymin, Thymin, Cytosin… - 3'-Ende

3'-Ende -… Cytosin, Thymin, Thymin, Adenin, Adenin, Guanin… - 5'-Ende

Wenn beispielsweise das Restriktionsenzym innerhalb der Sequenz zwischen Guanin und Adenin schneidet, würde dies bei beiden Sequenzen geschehen, jedoch an entgegengesetzten Enden (da die zweite Sequenz in die entgegengesetzte Richtung verläuft). Da die DNA an beiden Strängen geschnitten wird, gibt es komplementäre Enden, die Wasserstoffbrücken miteinander verbinden können. Diese Enden werden oft als "klebrige Enden" bezeichnet.

Was ist DNA-Ligase??

Die klebrigen Enden der Fragmente, die durch Restriktionsenzyme erzeugt werden, sind in einer Laborumgebung nützlich. Sie können verwendet werden, um DNA-Fragmente aus verschiedenen Quellen und verschiedenen Organismen zu verbinden. Die Fragmente werden durch Wasserstoffbrücken zusammengehalten. Aus chemischer Sicht sind Wasserstoffbrücken schwache Anziehungskräfte und nicht permanent. Bei Verwendung eines anderen Enzymtyps können die Bindungen jedoch permanent gemacht werden.

DNA-Ligase ist ein sehr wichtiges Enzym, das sowohl bei der Replikation als auch bei der Reparatur der DNA einer Zelle eine Rolle spielt. Es hilft beim Zusammenfügen von DNA-Strängen. Es katalysiert eine Phosphodiesterbindung. Diese Bindung ist eine kovalente Bindung, die viel stärker ist als die zuvor erwähnte Wasserstoffbindung und die in der Lage ist, die verschiedenen Fragmente zusammenzuhalten. Wenn verschiedene Quellen verwendet werden, weist die resultierende rekombinante DNA, die hergestellt wird, eine neue Kombination von Genen auf.

Restriktionsenzymtypen

Es gibt vier breite Kategorien von Restriktionsenzymen: Typ I-Enzyme, Typ II-Enzyme, Typ III-Enzyme und Typ IV-Enzyme. Alle haben die gleiche Grundfunktion, aber die verschiedenen Typen werden anhand ihrer Erkennungssequenz, ihrer Spaltung, ihrer Zusammensetzung und ihres Substanzbedarfs (Bedarf und Art der Cofaktoren) klassifiziert. Im Allgemeinen schneiden Typ I-Enzyme DNA an Orten, die von der Erkennungssequenz entfernt sind; Typ II-geschnittene DNA innerhalb oder nahe der Erkennungssequenz; Typ III schnitt DNA nahe Erkennungssequenzen; und Typ IV spalten methylierte DNA.

Quellen

• Biolabs, New England. "Arten von Restriktionsendonukleasen." New England Biolabs: Reagenzien für die Biowissenschaftsindustrie, www.neb.com/products/restriction-endonucleases/restriction-endonucleases/types-of-restriction-endonucleases.
• Reece, Jane B. und Neil A. Campbell. Campbell Biology. Benjamin Cummings, 2011.