10X FSME-Elektrophorese-Puffer herstellen

FSME und TAE werden in der Molekularbiologie vor allem zur Elektrophorese von Nukleinsäuren als Puffer eingesetzt. Tris-Puffer werden unter leicht basischen pH-Bedingungen wie bei der DNA-Elektrophorese verwendet, da dadurch die DNA in der Lösung löslich bleibt und deprotoniert wird, sodass sie von der positiven Elektrode angezogen wird und durch ein Gel wandert. EDTA ist ein Bestandteil der Lösung, da dieser übliche Chelatbildner die Nukleinsäuren vor dem Abbau durch Enzyme schützt. Das EDTA chelatiert zweiwertige Kationen, die Cofaktoren für Nukleasen sind, die die Probe kontaminieren können. Da das Magnesiumkation jedoch ein Cofaktor für DNA-Polymerase und Restriktionsenzyme ist, wird die Konzentration von EDTA absichtlich niedrig gehalten (etwa 1 mM Konzentration)..

10X FSME-Elektrophorese-Puffermaterialien

• 108 g Tris-Base [Tris (hydroxymethyl) aminomethan]
• 55 g Borsäure
• 7,5 g EDTA, Dinatriumsalz
• Entionisiertes Wasser

Vorbereitung für den 10X FSME-Elektrophorese-Puffer

1. Tris, Borsäure und EDTA in 800 ml entionisiertem Wasser auflösen.
2. Den Puffer auf 1 l verdünnen. Ungelöste weiße Klumpen können gelöst werden, indem die Flasche mit der Lösung in ein heißes Wasserbad gestellt wird. Ein Magnetrührstab kann den Prozess unterstützen.

Sie müssen die Lösung nicht sterilisieren. Obwohl es nach einiger Zeit zu Ausfällungen kommen kann, ist die Stammlösung noch verwendbar. Sie können den pH-Wert mit einem pH-Meter einstellen und konzentrierte Salzsäure (HCl) zutropfen. Es ist in Ordnung, den FSME-Puffer bei Raumtemperatur zu lagern, obwohl Sie die Stammlösung möglicherweise durch einen 0,22-Mikrometer-Filter filtern möchten, um Partikel zu entfernen, die die Ausfällung fördern würden.

10X TBE Elektrophorese Puffer Lagerung

Lagern Sie die Flasche mit 10x Pufferlösung bei Raumtemperatur. Die Kühlung beschleunigt die Ausfällung.

Verwendung von 10X FSME-Elektrophorese-Puffer

Die Lösung wird vor Gebrauch verdünnt. 100 ml 10facher Stammlösung werden mit entionisiertem Wasser auf 1 l verdünnt.

Rezept für 5-fache FSME-Stammlösung

Der Vorteil der 5X-Lösung besteht darin, dass es weniger wahrscheinlich ist, dass sie ausfällt.

• 54 g Tris-Base (Trizma)
• 27,5 g Borsäure
• 20 ml 0,5 M EDTA-Lösung
• Entionisiertes Wasser

Vorbereitung

1. Tris-Base und Borsäure in der EDTA-Lösung lösen.
2. Stellen Sie den pH-Wert der Lösung mit konzentrierter HCl auf 8,3 ein.
3. Verdünne die Lösung mit entionisiertem Wasser, um 1 Liter 5X Stammlösung zu erhalten. Die Lösung kann zur Elektrophorese auch auf das 1-fache oder das 0,5-fache verdünnt werden.

Die versehentliche Verwendung einer 5- oder 10-fachen Stammlösung führt zu schlechten Ergebnissen, da so viel Wärme erzeugt wird. Zusätzlich zu einer schlechten Auflösung kann die Probe beschädigt werden.

0,5-faches TBA-Pufferrezept

• 5X TBE Stammlösung
• Destilliertes entionisiertes Wasser

Vorbereitung

100 ml der 5 × TBE-Lösung werden zu 900 ml destilliertem entionisiertem Wasser gegeben. Vor Gebrauch gut mischen.

Einschränkungen

Obwohl TBE und TAE übliche Elektrophoresepuffer sind, gibt es andere Optionen für niedermolekulare leitfähige Lösungen, einschließlich Lithiumboratpuffer und Natriumboratpuffer. Das Problem bei FSME und TAE besteht darin, dass Tris-basierte Puffer das elektrische Feld begrenzen, das bei der Elektrophorese verwendet werden kann, da zu viel Ladung zu einem Durchgehen der Temperatur führt.