Steins experimentelles Schreiben gewann ihre Glaubwürdigkeit bei denen, die modernistische Literatur schufen, aber nur ein Buch, das sie schrieb, war finanziell erfolgreich.
Gertrude Stein wurde als jüngstes von fünf Kindern jüdisch-amerikanischer Eltern in Allegheny, Pennsylvania, geboren. Als sie sechs Monate alt war, ging ihre Familie nach Europa: zuerst nach Wien, dann nach Paris. So lernte sie mehrere andere Sprachen, bevor sie Englisch lernte. Die Familie kehrte 1880 nach Amerika zurück und Gertrude Stein wuchs in Oakland und San Francisco, Kalifornien, auf.
1888 starb Gertrude Steins Mutter nach einem langen Kampf gegen den Krebs, und 1891 starb ihr Vater plötzlich. Ihr ältester Bruder Michael wurde Vormund der jüngeren Geschwister. 1892 zogen Gertrude Stein und ihre Schwester nach Baltimore, um bei Verwandten zu leben. Ihr Erbe reichte aus, um bequem zu leben.
Gertrude Stein wurde 1893 als Sonderschülerin in das Harvard Annex aufgenommen (es wurde im nächsten Jahr in Radcliffe College umbenannt), während ihr Bruder Leo Harvard besuchte. Sie studierte Psychologie bei William James und machte ihren Abschluss magna cum laude im Jahr 1898.
Gertrude Stein studierte vier Jahre Medizin bei Johns Hopkins und schloss das Studium ohne Abschluss ab, nachdem sie Schwierigkeiten mit ihrem letzten Studienjahr hatte. Ihr Abschied war möglicherweise mit einer gescheiterten Romanze mit May Bookstaver verbunden, über die Gertrude später schrieb. Oder es könnte sein, dass ihr Bruder Leo bereits nach Europa gereist war.
1903 zog Gertrude Stein nach Paris, um bei ihrem Bruder Leo Stein zu wohnen. Sie begannen Kunst zu sammeln, da Leo Kunstkritiker werden wollte. In ihrem Haus in der Rue de Fleurus 27 wurden ihre Samstags-Salons eingerichtet. Um sie herum versammelte sich ein Kreis von Künstlern, darunter Persönlichkeiten wie Picasso, Matisse und Gris, die Leo und Gertrude Stein dazu beitrugen, die Öffentlichkeit auf sich aufmerksam zu machen. Picasso malte sogar ein Porträt von Gertrude Stein.
1907 lernte Gertrude Stein Alice B. Toklas kennen, eine andere wohlhabende jüdische Kalifornierin, die ihre Sekretärin, Amanuensis und Lebensgefährtin wurde. Stein nannte die Beziehung eine Ehe, und Liebesbriefe, die in den 1970er Jahren veröffentlicht wurden, enthüllen mehr über ihr intimes Leben, als sie zu Steins Lebzeiten öffentlich diskutierten. Zu Steins Lieblingsnamen für Toklas gehörten "Baby Precious" und "Mama Woojums", und zu Toklas für Stein gehörten "Mr. Cuddle-Wuddle" und "Baby Woojums".
Bis 1913 hatte sich Gertrude Stein von ihrem Bruder Leo Stein getrennt, und 1914 teilten sie die Kunst, die sie gesammelt hatten, auf.
Während Pablo Picasso einen neuen künstlerischen Ansatz im Kubismus entwickelte, entwickelte Gertrude Stein einen neuen Ansatz zum Schreiben. Sie schrieb Das Making of der Amerikaner 1906 bis 1908, aber erst 1925 erschienen. 1909 erschien Gertrude Stein Drei Leben, drei Geschichten, darunter "Melanctha" von besonderer Bedeutung. 1915 veröffentlichte sie Ausschreibungstaste, was als "verbale Collage" beschrieben wurde.
Gertrude Steins Schriften brachten ihr weiteres Renommee und ihr Zuhause und ihre Salons wurden von vielen Schriftstellern und Künstlern frequentiert, darunter auch von vielen amerikanischen und englischen Expatriates. Sie unterrichtete unter anderem Sherwood Anderson und Ernest Hemingway in ihren schriftstellerischen Bemühungen.
Während des Ersten Weltkrieges stellten Gertrude Stein und Alice B. Toklas weiterhin einen Treffpunkt für die Modernisten in Paris dar, aber sie arbeiteten auch daran, die Kriegsanstrengungen zu unterstützen. Stein und Toklas lieferten medizinische Versorgung und finanzierten ihre Bemühungen durch den Verkauf von Stücken aus Steins Kunstsammlung. Stein erhielt von der französischen Regierung für ihre Verdienste eine Anerkennungsmedaille (Médaille de la Réconnaissance Francoise, 1922).
Nach dem Krieg war es Gertrude Stein, die den Ausdruck "verlorene Generation" prägte, um die enttäuschten englischen und amerikanischen Expatriates zu beschreiben, die Teil des Kreises um Stein waren.
1925 sprach Gertrude Stein in Oxford und Cambridge in einer Reihe von Vorlesungen, um sie auf sich aufmerksam zu machen. Und 1933 veröffentlichte sie ihr Buch, Die Autobiographie von Alice B. Toklas, das erste von Gertrude Steins Schriften, das finanziell erfolgreich war. In diesem Buch nimmt Stein die Stimme von Alice B. Toklas schriftlich über sich (Stein) auf und enthüllt erst gegen Ende ihre Urheberschaft.
Gertrude Stein wagte sich in ein anderes Medium: Sie schrieb das Libretto einer Oper "Vier Heilige in drei Akten", und Virgil Thomson schrieb die Musik dafür. Stein reiste 1934 nach Amerika, hielt Vorträge und sah das Operndebüt in Hartford, Connecticut, und wurde in Chicago aufgeführt.
Als der Zweite Weltkrieg näher rückte, veränderte sich das Leben von Gertrude Stein und Alice B. Toklas. 1938 verlor Stein den Pachtvertrag in der Rue de Fleurus 27, und 1939 übersiedelte das Ehepaar in ein Landhaus. Sie haben das Haus später verloren und sind nach Culoz gezogen. Obwohl jüdisch, feministisch, amerikanisch und intellektuell, wurden Stein und Toklas während der Besetzung von 1940 bis 1945 durch eng verbundene Freunde vor den Nazis geschützt. Zum Beispiel hat der Bürgermeister in Culoz ihre Namen nicht in die Liste der Einwohner aufgenommen, die den Deutschen ausgehändigt wurden.
Stein und Toklas kehrten vor der Befreiung Frankreichs nach Paris zurück und trafen viele amerikanische GIs. Stein schrieb über diese Erfahrung in einem anderen Buch.
Das Jahr 1946 brachte das Debüt von Gertrude Steins zweiter Oper "Die Mutter von uns allen", die Geschichte von Susan B. Anthony.
Gertrude Stein wollte nach dem Zweiten Weltkrieg in die USA zurückkehren, stellte jedoch fest, dass sie an nicht operierbarem Krebs litt. Sie starb am 27. Juli 1946.
Im Jahr 1950, Dinge wie sie sind, Gertrude Steins Roman über lesbische Beziehungen aus dem Jahr 1903 wurde veröffentlicht.
Alice B. Toklas lebte bis 1967 und schrieb vor ihrem Tod ein Buch mit ihren eigenen Erinnerungen. Toklas wurde auf dem Pariser Friedhof neben Gertrude Stein beigesetzt.