John Singleton Mosby wurde am 6. Dezember 1833 in Powhatan County, VA, als Sohn von Alfred und Virginny Mosby geboren. Im Alter von sieben Jahren zogen Mosby und seine Familie nach Albemarle County in der Nähe von Charlottesville. Mosby wurde vor Ort erzogen, war ein kleines Kind und wurde häufig aufgegriffen, trat jedoch selten von einem Kampf zurück. Als Mosby 1849 an der University of Virginia eintrat, erwies er sich als ein begabter Student, der sich in Latein und Griechisch auszeichnete. Als Student geriet er in einen Kampf mit einem örtlichen Mobber, bei dem er den Mann in den Nacken schoss.
Mosby wurde von der Schule verwiesen und wegen widerrechtlichen Schießens zu sechs Monaten Gefängnis und einer Geldstrafe von 1.000 US-Dollar verurteilt. Nach dem Prozess beantragten mehrere Geschworene die Freilassung von Mosby, und am 23. Dezember 1853 entschuldigte der Gouverneur. Während seiner kurzen Zeit im Gefängnis freundete sich Mosby mit dem örtlichen Staatsanwalt William J. Robertson an und zeigte Interesse am Studium der Rechtswissenschaften. Mosby las in Robertsons Büro Jura und wurde schließlich als Rechtsanwalt zugelassen. Er eröffnete seine eigene Praxis im nahe gelegenen Howardsville, VA. Kurz darauf lernte er Pauline Clarke kennen und die beiden heirateten am 30. Dezember 1857.
Das Paar ließ sich in Bristol, VA, nieder und hatte vor Ausbruch des Bürgerkriegs zwei Kinder. Zunächst ein Gegner der Sezession, trat Mosby sofort in die Washington Mounted Rifles (1. Virginia Cavalry) ein, als sein Staat die Union verließ. Mosby kämpfte als Privatmann in der ersten Schlacht von Bull Run und stellte fest, dass ihm militärische Disziplin und traditionelles Soldatentum nicht gefielen. Trotzdem erwies er sich als fähiger Kavallerist und wurde bald zum Oberleutnant befördert und zum Adjutanten des Regiments ernannt.
Als sich die Kämpfe im Sommer 1862 auf die Halbinsel verlagerten, meldete sich Mosby freiwillig als Späher für Brigadegeneral J.E.B. Stuarts berühmte Fahrt um die Armee des Potomac. Nach diesem dramatischen Feldzug wurde Mosby am 19. Juli 1862 in der Nähe der Beaver Dam Station von Unionstruppen gefangen genommen. Mosby wurde nach Washington gebracht und beobachtete sorgfältig seine Umgebung, als er zum Austausch nach Hampton Roads gebracht wurde. Als er bemerkte, dass Schiffe mit dem Kommando von Generalmajor Ambrose Burnside aus North Carolina ankamen, meldete er diese Information sofort nach seiner Freilassung an General Robert E. Lee.
Diese Informationen halfen Lee bei der Planung der Kampagne, die in der zweiten Schlacht von Bull Run gipfelte. In diesem Herbst begann Mosby, sich für Stuart einzusetzen, um ihm die Schaffung eines unabhängigen Kavalleriekommandos in Nord-Virginia zu ermöglichen. Diese Einheit, die nach dem Partisanen-Ranger-Gesetz der Konföderation arbeitet, würde kleine, schnelle Überfälle auf die Kommunikations- und Versorgungslinien der Union durchführen. Mosby, der versuchte, seinem Helden aus der amerikanischen Revolution, dem Partisanenführer Francis Marion (The Swamp Fox), zu folgen, erhielt schließlich im Dezember 1862 die Erlaubnis von Stuart und wurde im folgenden März zum Major befördert.
Mosby rekrutierte in Nord-Virginia und schuf eine Truppe irregulärer Truppen, die als Partisanen-Ranger eingesetzt wurden. Sie bestanden aus Freiwilligen aus allen Gesellschaftsschichten, lebten in der Gegend, verschmolzen mit der Bevölkerung und kamen zusammen, als sie von ihrem Kommandeur zusammengerufen wurden. Sie führten Nachtangriffe gegen Außenposten der Union und Versorgungskonvois durch und trafen dort, wo der Feind am schwächsten war. Obwohl seine Streitmacht an Größe zunahm (240 bis 1864), wurde sie selten kombiniert und traf oft mehrere Ziele in derselben Nacht. Diese Streuung der Kräfte hielt die Verfolger der Mosby-Union aus dem Gleichgewicht.
Am 8. März 1863 überfielen Mosby und 29 Männer das Fairfax County Court House und nahmen Brigadegeneral Edwin H. Stoughton fest, während er schlief. Andere gewagte Missionen waren Angriffe auf Catlett Station und Aldie. Im Juni 1863 wurde Mosbys Kommando zum 43. Partisanenbataillon ernannt. Obwohl von den Streitkräften der Union verfolgt, erlaubte die Art von Mosbys Einheit seinen Männern, nach jedem Angriff einfach zu verschwinden und keine Spur zu hinterlassen, der sie folgen konnten. Frustriert von Mosbys Erfolgen erließ Generalleutnant Ulysses S. Grant 1864 ein Edikt, wonach Mosby und seine Männer als Gesetzlose ausgewiesen und ohne Gerichtsverfahren aufgehängt werden sollten, wenn sie gefangen genommen wurden.
Als die Streitkräfte der Union unter Generalmajor Philip Sheridan im September 1864 in das Shenandoah-Tal einzogen, begann Mosby gegen seinen Rücken zu operieren. Später in diesem Monat wurden sieben von Mosbys Männern gefangen genommen und von Brigadegeneral George A. Custer in Front Royal, VA, aufgehängt. Mosby erwiderte eine Gegenleistung und tötete fünf Unionsgefangene (zwei weitere flohen). Ein wichtiger Triumph ereignete sich im Oktober, als es Mosby gelang, Sheridans Gehaltsliste während des "Greenback Raid" zu erfassen. Als die Situation im Tal eskalierte, schrieb Mosby am 11. November 1864 an Sheridan und forderte die Rückkehr zur gerechten Behandlung der Gefangenen.
Sheridan stimmte dieser Bitte zu und es wurden keine weiteren Morde verübt. Von Mosbys Überfällen enttäuscht, organisierte Sheridan eine speziell ausgerüstete Einheit von 100 Männern, um den konföderierten Partisanen zu fangen. Diese Gruppe, mit Ausnahme von zwei Männern, wurde am 18. November von Mosby getötet oder gefangen genommen. Mosby, der im Dezember zum Oberst befördert wurde, sah, dass sein Kommando auf 800 Mann aufstieg, und setzte seine Aktivitäten bis zum Ende des Krieges im April 1865 fort. Mosby war nicht bereit, sich förmlich zu ergeben, und überprüfte seine Männer zum letzten Mal am 21. April 1865, bevor er seine Einheit auflöste.
Nach dem Krieg verärgerte Mosby viele im Süden, indem er Republikaner wurde. In der Überzeugung, dass dies der beste Weg war, die Nation zu heilen, freundete er sich mit Grant an und diente als Vorsitzender seiner Präsidentschaftskampagne in Virginia. Als Reaktion auf Mosbys Aktionen erhielt der ehemalige Partisan Morddrohungen und ließ sein Jugendheim niederbrennen. Darüber hinaus wurde mindestens ein Versuch in seinem Leben unternommen. Um ihn vor diesen Gefahren zu schützen, ernannte Grant ihn 1878 zum US-Konsul nach Hongkong. Als Mosby 1885 in die USA zurückkehrte, arbeitete er als Anwalt in Kalifornien für die Southern Pacific Railroad, bevor er verschiedene Regierungsposten übernahm. Mosby war zuletzt Generalstaatsanwalt im Justizministerium (1904-1910). Er starb am 30. Mai 1916 in Washington DC und wurde auf dem Warrenton Cemetery in Virginia beigesetzt.